Depende, pois precisamos saber as características dos analitos de interesse e, não só eles, como toda a composição da matriz que iremos trabalhar, sem contar, obviamente, de qual é o objetivo do método, para qual finalidade ele será utilizado e o que é esperado dos resultados vindo deste procedimento.
Antes de entrar nessa conversa sobre os modos de eluição, vamos relembrar alguns conceitos importantes. Quando falamos em HPLC ou UPLC, precisamos ter em mente que a Fase Estacionária, na qual os analitos (nossas substâncias de interesse, as quais queremos analisar) ficarão retidos para que a separação ocorra, é composta de um material sólido, tradicionalmente, são as colunas cromatográficas. Enquanto a Fase Móvel, na qual os analitos irão solubilizar e então promover a eluição dos compostos que estão ligados na fase estacionária, trata-se de uma composição de solventes, ou seja, um material líquido. Outro conceito é a Força da fase móvel, que está relacionada ao quanto de afinidade do analito em relação a fase estacionária, didaticamente falando, quanto mais forte a fase móvel, mais o analito irá preferir se desligar da fase estacionária e seguir junto ao fluxo de fase móvel.
Tendo em mente que a fase móvel, que iremos carinhosamente chamar aqui de FM, é um solvente ou uma composição de diferentes solventes (desde que compatíveis, importante ressaltar), iremos esclarecer que Isocrático, do grego ISO = igual e CRÁTICO = força, assim, temos então uma FM de igual força durante toda a corrida cromatográfica, dessa maneira, a composição dos solventes de FM será uma só, são aquelas que preparamos em um único frasco, do qual o sistema cromatográfico irá bombear 100% deste único canal. Do outro lado, o substantivo Gradiente está relacionado com uma variação gradativa de uma característica, trazendo para nosso contexto, neste modo de eluição, a força da FM irá subir gradativamente, então nesse tipo de análise a força inicial da FM é sempre menor que a força no final da corrida. Isso acontece com uma variação de proporção dos solventes utilizados, são aqueles métodos que colocamos no mínimo dois frascos de FM no sistema e programamos diferentes proporções dos canais em relação ao tempo.
Com toda a introdução teórica abordada e conceitos relembrados, vamos para uma resposta mais abrangente do que o “depende”.
O modo de eluição isocrático é mais utilizado quando existe um número baixo de analitos de interesse, com complexidade baixa da matriz. Principalmente quando o interesse é analisar apenas um pico, como por exemplo, análises de teor de IFA ou quantificação de uma classe de compostos com solubilidade e dimensão molecular muito próxima. Pois, quando as características físico-químicas dos analitos são parecidas, a força da FM que será necessária para cromatografar essa mistura e resultar em uma resolução adequada será praticamente igual para todas as substâncias, deixando o trabalho mais crítico para a fase estacionária.
Por outro lado, quando se tem uma mistura muito heterogênea de substâncias para serem separadas em um único método cromatográfico ou quando a matriz é muito complexa ou “suja”, o modo gradiente é mais indicado, já que teremos analitos com características físico-químicas muito distintas, exigindo que a FM tenha força variável para conseguir eluir todos os compostos de interesse da coluna cromatográfica. Quando falamos em matrizes complexas e “sujas”, é bem provável que tenhamos que fazer uma limpeza pós-corrida, porque a chance de muitos compostos indesejáveis ficarem retidos na coluna e interferirem nos pratos teóricos é extremamente alta e, esta limpeza pode ser realizada no final da corrida, com um gradiente de FM.
Agora, uma dica aos desenvolvedores de métodos cromatográficos, ao iniciar um estudo, é muito interessante que se faça um Gradiente Exploratório, aquele que inicia na composição mais fraca possível de FM, aumentando levemente sua força, até o máximo possível. Este tipo de procedimento será extremamente útil para conhecer as características de sua amostra e, certamente, será um excelente ponto de partida para determinação da composição final do seu método. Na hora de determinar seu método, não se esqueçam que, dentro do laboratório existem outras variáveis a serem consideradas, como expectativas e prazos, que também determinam o modo a ser utilizado.
Então, de uma maneira bem simples, sintetizando o que falamos neste texto, iremos utilizar FM isocrática para análises simples, com um ou poucos analitos de características parecidas e, FM gradiente em misturas heterogêneas e complexas.